基因编辑：转座酶打开 CRISPR 系统新领域的大门_公司新闻

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基因编辑：转座酶打开 CRISPR 系统新领域的大门

人阅读发布时间：2021-04-06 18:09

CRISPR/Cas 系统一经发现就立马得到广大生命科学研究者的青睐——以其精准、高效、快捷的基因靶向编辑的功能。以目前最受到关注的 CRISPR/Cas9 系统为例（Fig.1），介由 single-guided RNA（sgRNA）引导，Cas9 蛋白成功锚定到目的 DNA 靶区域（PAM 区域下游），蛋白所具有的 HNH、RuvC 活性区域会将目的 DNA 切出一个平末端。此时细胞会进行内源 DNA 损伤修复来修复末端或者研究人员们会引入一段与末端同源的 DNA 片段（donor DNA）与断裂的 DNA 进行同源重组修复。此后随着研究的深入，研究者又在此基础上开发出了两种新的编辑方法：其一是突变 Cas9 蛋白上 HNH、RuvC 中的某一个区域 (Cas9nickase，nCas9)，然后由不同的 sgRNA 引导形成双蛋白锚定系统并剪切出粘性末端，继而再引入 donor DNA 进行重组修复；其二是双突变 Cas9 蛋白上的 HNH、RuvC 活性区域 (dead Cas9，dCas9) 使之只能进行定位结合，同时附着 Fok I 酶行使剪切功能。这样的双锚定系统有效降低了基因编辑的脱靶效应，然而即便如此，如何完成「万无一失」的靶向编辑仍然是该项技术走向临床的重要挑战之一。

Fig.1：Cas9、nCas9、dCas9-Fok I 剪切模型

2019 年 6 月，CRISPR 基因编辑的业界著名专家张锋教授又有了新的发现。张锋实验室在蓝藻中发现一种转座酶，它的三个亚基可以和 Cas12k 蛋白关联从而构成一种关联转座酶的 CRISPR 系统（CRISPR-associated transposase fromcyanobacteria Scytonema hofmanni，ShCAST）。（Fig.2）

Fig.2：ShCAST 结构模型

CRISPR/Cas 的诸多变体当中，Cas12k 缺乏核酸酶结构域，同样经 sgRNA 引导结合至目的 DNA 的 PAM 区域下游，而与其关联的三个转座酶亚基 tnsB，tnsC，tniQ 则将识别 donorDNA 两端的转座子末端序列（transposonleft end (LE) and right end (RE)）剪切下来并且插入 PAM 区下游 60～66bp 处（Fig.3）。

Fig.3：ShCAST 转座模型

实验表明 ShCAST 系统能将 2.5kb 的片段插入靶位点且插入频率高达 80%，同时不经过同源重组途径（Fig.4）。虽然目前该实验只在细菌中重复过且仍然有脱靶风险，但是依然为我们展现了 CRISPR 基因编辑方法行之有效的美好愿景。

Fig.4：ShCAST 转座实验流程与 PCR 检测结果

目前，吉玛基因公司已经积累成功捕获高纯度 Cas9 蛋白的实验经验，且可检测具有良好的识别（结合）与剪切活性（Fig.5），欢迎大家咨询、合作！

Fig.5：吉玛基因 Cas9 蛋白纯化 SDS-PAGE 电泳与 DNA 剪切琼脂糖电泳结果

参考文献

Wang H , Russa M L , Qi L S . CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond[J]. Annual Review of Biochemistry, 2016, 85(1).

[1]Strecker Jonathan , Ladha Alim , Gardner Zachary , Schmid-Burgk Jonathan L , Makarova Kira S , Koonin Eugene V , Zhang Feng. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases.[J]. Science (New York, N.Y.),2019,365(6448).

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