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必看干货：RNAi 无效原因解析
人阅读 发布时间：2023-11-01 14:45
研究基因功能，最常用的就是做基因干扰--RNAi。无论是用 siRNA，shRNA，都可能面临一个让人抓狂的问题——干扰无效！经过数天的劳时费力，头发半秃，一顿操作猛如虎，一看干扰数据 2.5! 目的基因不光没有干扰，还上调了！为啥呢？
一般来说，如果加入 siRNA 或者 shRNA 没有干扰效果，有如下几个原因：
1、转染效率低：这个是非常常见的问题，如果少量 siRNA 进入细胞，作用于基因后，有时候会有少量干扰，但是也有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。所以在实验前，都要先摸索一下转染条件。如果是 siRNA，可以先用 FAM-NC 来确定一下转染效率，如果是 shRNA 质粒，可以荧光对照质粒来确定。进行转染时，要参考说明书上的浓度，但是这个浓度只是推荐浓度，不是万.能浓度， 不同细胞的转染难易程度不一养，可以在转染试剂说明书用量的 0.5-3 倍摸索一下。找到一个最佳（大于 70%）的转染条件， 就用这个条件来做目的基因的干扰实验。
3、我们推荐 RT-PCR 的引物设计在 target 位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的 siRNA 介导的基因 knockdown 机制是 RSIC 先介导靶 mRNA 的切割，切割导致靶 mRNA 的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果或 knockdown 效率的低估。由于我们做干扰实验通常会用多个 siRNA/shRNA 同时做实验进行验证，如果都跨 siRNA 位点，需要多对引物，工作量太大，一般都是用一引物来进行验证。 如果引物设计位置离干扰位点比较远，这样 siRNA 干扰导致 RNA 断裂，但是没有导致整个基因碎掉的话，使用的引物是可以检测到的，会产生假阴性，或者导致检测目的基因检测量上调。建议在离干扰位点比较近的位置设计引物。
4、基因问题：有的基因表达量很低，比如目的基因和内参相差 15 个 CT 值，就是低丰度基因，干扰这种低丰度的基因，是很难干扰下来的。反而经常会刺激表达，产生上调作用。如果引物没有问题（可能扩增效率低，可以用多对引物验证），建议更换细胞，找一个表达丰度高的细胞进行干扰验证，如果一定要在这个细胞做实验，建议做过表达，比较容易出结果；有的目的基因功能比较特殊，要受到比较严格的细胞调控，这样也不容易干扰，可以考虑用crisper 来做；由于 siRNA/shRNA 在胞浆内进行干扰，对核内的基因，比如一些 lncRNA，用 siRNA/shRNA 干扰效果比较差，对这种核内的基因，建议用 ASO 来做。
5、siRNA/shRNA 降解：siRNA 不稳定，溶解降解，收到后建议 -20 保存，溶解后要最小量分装，-20 或者 -80 保存，3 个月内用完，避免反复冻融或者4度保存，使用的管子枪头一定要经过无酶处理。 shRNA 质粒长期保存质粒也会降解，可以通过重新摇菌抽提新鲜质粒来进行改善。
6、干扰靶点不合适。在设计的时候，提供的是根据预测可能有好的干扰效果的靶点。但是，实际干扰效果还是以实验结果为准。如果您订购的是套餐，在转染效率达到 70 %以上时，目的基因没有达到 70% 左右干扰效果的话，提供相关结果过来，我们再免费重新设计合成一次哦。
目前我们在做活动，订购 siRNA 套餐，除了固定赠送不变：送 NC、FAM-NC、和阳性对照各 1OD 以外，还可以赠送其他好礼哦
一般来说，如果加入 siRNA 或者 shRNA 没有干扰效果，有如下几个原因：
1、转染效率低：这个是非常常见的问题，如果少量 siRNA 进入细胞，作用于基因后，有时候会有少量干扰，但是也有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。所以在实验前，都要先摸索一下转染条件。如果是 siRNA，可以先用 FAM-NC 来确定一下转染效率，如果是 shRNA 质粒，可以荧光对照质粒来确定。进行转染时，要参考说明书上的浓度，但是这个浓度只是推荐浓度，不是万.能浓度， 不同细胞的转染难易程度不一养，可以在转染试剂说明书用量的 0.5-3 倍摸索一下。找到一个最佳（大于 70%）的转染条件， 就用这个条件来做目的基因的干扰实验。
图1 FAM-NC 转染后的细胞图
点状荧光是 siRNA 和转染试剂形成的复合体，转染进去整个细胞发荧光
3、检测时间点：siRNA 和 shRNA 转染到细胞后，绑定目的基因，导致目的基因降解，干扰效果越来越好，但是随着RNA被降解，细胞分裂增值，子代细胞内可能就没有 siRNA 或者 shRNA 了，干扰效果又会越来越差。所以干扰效果是抛物线型的，建议转染后 24-48 小时检测基因水平变化，48-72 小时检测蛋白水平变化。并且不同序列或者基因的半衰期也不一样，最佳干扰时间点是不同，多做几个时间点有利于 siRNA干 扰效果的测定。
图2 干扰效果和时间关系示意图
3、我们推荐 RT-PCR 的引物设计在 target 位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的 siRNA 介导的基因 knockdown 机制是 RSIC 先介导靶 mRNA 的切割，切割导致靶 mRNA 的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果或 knockdown 效率的低估。由于我们做干扰实验通常会用多个 siRNA/shRNA 同时做实验进行验证，如果都跨 siRNA 位点，需要多对引物，工作量太大，一般都是用一引物来进行验证。 如果引物设计位置离干扰位点比较远，这样 siRNA 干扰导致 RNA 断裂，但是没有导致整个基因碎掉的话，使用的引物是可以检测到的，会产生假阴性，或者导致检测目的基因检测量上调。建议在离干扰位点比较近的位置设计引物。
图3 引物和干扰位点关系示意图
4、基因问题：有的基因表达量很低，比如目的基因和内参相差 15 个 CT 值，就是低丰度基因，干扰这种低丰度的基因，是很难干扰下来的。反而经常会刺激表达，产生上调作用。如果引物没有问题（可能扩增效率低，可以用多对引物验证），建议更换细胞，找一个表达丰度高的细胞进行干扰验证，如果一定要在这个细胞做实验，建议做过表达，比较容易出结果；有的目的基因功能比较特殊，要受到比较严格的细胞调控，这样也不容易干扰，可以考虑用crisper 来做；由于 siRNA/shRNA 在胞浆内进行干扰，对核内的基因，比如一些 lncRNA，用 siRNA/shRNA 干扰效果比较差，对这种核内的基因，建议用 ASO 来做。
6、干扰靶点不合适。在设计的时候，提供的是根据预测可能有好的干扰效果的靶点。但是，实际干扰效果还是以实验结果为准。如果您订购的是套餐，在转染效率达到 70 %以上时，目的基因没有达到 70% 左右干扰效果的话，提供相关结果过来，我们再免费重新设计合成一次哦。
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