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公司新闻/正文
双荧光素酶检测——研究 miRNA 与靶基因调控的方法
13535 人阅读发布时间：2021-08-30 14:13
说起基因调控效果的检测，我们首先会想到的可能是 real-time PCR 和 Western blotting 这两种非常经典的方法。但作为一个学生物的，总有做不完的实验，实验更简便的同时还能更准确是不变的梦想（虽然有时可能是白日梦）。而双荧光素酶系统就是这么优秀的存在，转染之后裂解细胞就能通过酶标仪检测快速得出结果，且定量更精确。
研究 miRNA 与靶基因调控关系的过程是通过干扰 mRNA 的表达从而影响荧光蛋白的翻译，这一过程会造成荧光表达量的差异，从而评价 miRNA 调控靶基因表达的效果。具体我们会分为下面几个问题慢慢介绍。
1. 什么是双荧光素酶报告体系？
要回答这个问题，我们首先荧光了解一下什么是荧光素酶（luciferase）。荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶，其中最有代表性的就是萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）。萤火虫荧光素酶翻译后不需修饰就具有酶活，是一个理想的遗传报告基因。在 ATP，Mg2+ 和 O2 存在下，荧光素（luciferin）受到荧光素酶催化而发生氧化反应，这就是荧光产生的过程。
所谓荧光素酶报告基因系统，就是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统，测定反应过程中释放的生物荧光。而双荧光素酶报告体系，即有两种荧光素酶，比较常见的组合是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个（海肾荧光素酶基因）作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响，比如细胞数目及活力的差异，细胞转染及裂解效率。
2. 双荧光素酶报告基因检测有什么优点？
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拥有高灵敏度，比 Western blotting 灵敏度高 1000 倍以上；
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荧光素酶报告基因检测操作过程相对简单，只需要成功将含有目标 DNA 序列插入到报告载体中，即可进行后续实验，且发光检测相对更加方便；
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哺乳动物无内源性荧光素酶表达，荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；
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检测范围广，大于 7 个数量级。
3. 双荧光素酶报告基因检测的原理是什么？
将目的基因 3』-UTR 区域（3』-非编码区）或者 lncRNA（长链非编码 RNA）序列构建至双荧光素酶报告基因载体中荧光素酶基因的后面，然后转染至细胞（通常选择转染效率较高的 HEK-293T 细胞）中，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，检测报告基因表达的改变，可以定量反应 miRNA 对于目的基因的影响。结合定点突变等方法进一步确定 miRNA 与靶基因 3』UTR 的作用位点。
pmirGLO 是由普洛麦格（Promega）开发的，目前常用的一种商品化双荧光素酶报告载体。
图：Promega pmirGLO 双荧光素酶 miRNA 靶表达载体
pmirGLO 是设计用于定量分析 miRNA 活动的双荧光素酶报告载体，将萤火虫荧光素酶基因（luc2）和海肾荧光素酶基因（hRluc-neo）构建在一个载体上。萤火虫荧光素酶基因的 3』端有一个多重克隆区域（MCS 区域），这个区域中含有多个酶切位点，通过酶切连接过程可以插入 miRNA 靶点序列或者感兴趣基因的 3』非编码区，用于研究转录稳定性和活性。
重组质粒和 miRNA 共转染入细胞中，如果二者与靶基因有结合，荧光就会减弱；反过来如果二者与靶基因不结合，荧光则正常。
图：miRNA 与靶基因的相互作用对荧光的影响
4、双荧光素酶检测的基本流程是什么样的？
1）miRNA oligo 合成
2）重组质粒制备：将相应的基因片段构建入载体构建重组质粒
3）转染：用于 miRNA 靶标检测的重组质粒和 miRNA 共转染，通常在 24～48 h 后进行检测
4）细胞处理：细胞裂解和加入荧光素酶检测试剂等操作依照双荧光素酶检测试剂盒操作
5）荧光检测：使用酶标仪或具有类似功能的设备进行荧光强度检测
6）数据分析
图：酶标仪
5、尾巴：两个栗子
案例一
在这份发表在《Molecular cancer》的研究中，作者通过双荧光素酶报告系统探究了 linc00673 具有 miR-150-5p 是否具有靶向结合。将 linc00673 包括预测结合位点的序列克隆到 pmirGLO 载体上形成重组质粒 pmirGLO-linc00673-WT，同时构建相应的靶位点突变的重组质粒 pmirGLO-linc00673-MUT，二者分别共转染 NC mimics 和 miR-150-5p mimics，结果显示转入 miR-150-5p mimics 的实验组荧光值相对降低，提示存在靶向结合，miR-150-5p mimics 调控 linc00673 的表达。具体结果见下图。
图：运用双荧光素酶报告系统进行 linc00673 和 miR-150-5p 靶向结合研究的实验结果
案例二
吉玛基因提供成熟的双荧光素酶检测服务。客户只需提供靶基因和 miRNA 序列，吉玛负责从序列合成、载体构建到后续荧光检测的全程服务，结果严谨可靠，受到大量客户信任。
图：客户案例
参考文献
Lu W, Zhang H, Niu Y, et al. Long non-coding RNA linc00673 regulated non-small cell lung cancer proliferation, migration, invasion and epithelial mesenchymal transition by sponging miR-150-5p[J]. Molecular cancer, 2017, 16(1): 118.
吉玛基因一直致力于为大家提供高效、准确的科研服务，只要您提供整体实验方案，吉玛通过评估您的需求，围绕公司特色，结合现有平台及扩展平台，利用分子细胞生物学技术，提供可靠的实验数据，完成检测的全程服务，有需要的老师，记得联系我们哦！