- 移动端
上海吉玛制药技术有限公司
18 年
手机商铺
- NaN
- 0
- 0
- 1
- 0
推荐产品
公司新闻/正文
干货：siRNA 使用宝典
143 人阅读发布时间：2026-06-04 19:05
RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的特异性基因转录后沉默过程。细胞中的核酸酶Dicer 将 dsRNA 裂解成由 21-25 个核苷酸组成的小干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后 siRNA 特异性地降解相同序列的 mRNA。在2001年，Thomas Tuschl 首次证明体外合成的SiRNA可以成功干扰哺乳动物细胞内的目的基因，吉玛基因紧跟科学发展的脚步，于2003年开始合成siRNA，经过20多年的发展，目前使用公司siRNA产品发表SCI文章60000余篇，总影响因子达到30万以上，已经成为siRNA界的领头羊。
我们来介绍一下siRNA产品，看看怎么使用吧~一文在手，siRNA实验无忧！
一、siRNA产品说明
目的siRNA：干扰目的基因的siRNA，命名是基因名-物种-siRNA位点，比如P53-homo-282, 表示干扰的是人的P53，siRNA片段是基因282位点开始的19个碱基序列。
NC：是通用的一段无义序列，也是众多文献使用的对照序列，和哺乳动物都没有同源性，适用于大鼠、小鼠、人等不同基因的研究。不同siRNA赠送的NC都是一样的，NC是可以通用的哦。
DEPC水： 经过DEPC处理且高温高压去DEPC后的无菌无酶水，用来溶解RNA oligo，防止RNA快速降解。
阳性对照GAPDH： 阳性对照是针对管家基因GAPDH的有确定干扰效果的siRNA，是检测操作步骤的——如果操作没有问题，加了阳性对照siRNA后，这个管家基因GAPDH的量肯定会敲除70%以上（检测干扰GAPDH的效率时，内参一般选择用b-actin）。
FAM-NC：这个是带荧光的NC片段，用来确定转染效率，摸索转染条件——用不同的条件（根据转染试剂说明书给定用量的0.5-3倍）转染FAM-NC后，直接观察细胞内是否有荧光，来判断siRNA有没有转染到细胞中，方便确定最佳转染条件。优化好条件后，再用相同的条件来转染目的siRNA，可以基本确定目的RNA转进了细胞。
二、保存
吉玛提供的RNA oligo是干粉的，干粉比较稳定，可以常温运输。收到RNA oligo后，直接把干粉-20℃冻存，需要使用时再拿出来溶解。收到后不要先行溶解，干粉比溶液稳定，溶解后更容易降解。
三、溶解
1、拿出需要的siRNA准备溶解。
注意使用哪个siRNA，溶解哪个，不要全部溶解。如订购的siRNA套餐，需要先用FAM-NC摸索转染条件，就只溶解FAM-NC，其他的siRNA还是干粉冻存。等FAM-NC摸索好转染条件后，需要做目的siRNA转染时，再溶解目的siRNA，根据FAM-NC摸索的最佳用量来进行分装（比如说摸索的用量是10ul，就12ul分装一管），分装后冻存。
2、离心。
siRNA是干粉形式，通常是透明的，看不到（siRNA量大的话可以看到）。运输过程中干粉有可能飞到管壁、管盖上，所以溶解前先离心把RNA干粉离心到管底，转数可以3000-10000，离心时间是5-2分钟（转数低就多离心几分钟，转数高就少离心几分钟，只要把干粉离心到管底就可以）；
3、加DEPC水溶解。
对于21个碱基左右的双链siRNA/miRNA，1OD大约是2.5nmol，加125ul的DEPC水，得到20uM的浓度；对于21个碱基左右的单链RNA（inhibitor），1OD的大约是5nmol，需加250ul的DEPC水，得到20uM的浓度（如果是0.5 OD或者2OD分装，加入水量就减半或者加倍）。可以枪头反复吹打溶解混匀，也可以低速涡旋震荡溶解。
注意：siRNA转染时一般是用pmol来计算用量，如果按ug计算，1OD≈40ug左右，加125ul水溶解后，浓度是320ng/ul左右。
4、溶解后分装，不要反复冻融。
由于RNA容易降解，溶解使用DEPC水，溶解使用的管子、枪头也都要无酶无菌处理，以防止RNA oligo降解; 如果是荧光标记的RNA oligo，还需要用锡箔纸包一下防止淬灭；分装后3个月内用完（时间越久，降解越严重，可能会导致实验重复性不好）。
四、细胞转染
转染具体使用剂量：
siRNA一般工作浓度是30-150nM。具体用量要根据转染试剂说明书来确定，一般建议在说明书推荐剂量的0.5-3倍摸索。
如果使用siRNA-mate plus转染试剂，用量和操作如下：
推荐用量：
注：siRNA-mate plus摸索条件的时候，建议用3个条件摸索，siRNA+推荐用量1（常规细胞）；siRNA+推荐用量2（较难转的细胞）；2*siRNA+推荐用量2（难转染的细胞），这个条件下buffer用量也可以翻倍。
siRNA转染
注：培养基是完培，可以含有双抗和血清。转染24小时内可不换液，如需更长的培养时间按照正常细胞换液处理。
实验中需要注意细胞状态要好，代数不要大，细胞密度适中，50%左右（根据细胞生长情况调节），铺板时要铺均匀（可以先用培养液润湿培养皿表面，这样加入细胞后容易分散），添加转染复合物时要小心均匀滴加。如果细胞生长过快，建议用5%血清进行培养。
五、实验分组及干扰效率分析
用FAM-NC摸索好最佳转染用量以后。用同样的条件转染目的siRNA，组别建议设置：Blank、NC、siRNA1、siRNA 2、siRNA 3，转染后24、48小时两个时间点检测基因水平变化，48、72小时检测蛋白水平变化。和NC比较，看哪个siRNA能有效干扰目的基因，后续就用那个siRNA进行实验。
如果也要做阳性GAPDH siRNA，实验的时候可以多加一个阳性对照组，即Blank、NC、siRNA1、siRNA 2、siRNA 3，GAPDH，得到数据后，以NC为基准，目的siRNA分析目的基因的干扰效果，阳性对照分析对GAPDH的干扰效果。
六、siRNA无效原因解析
1、转染效率问题：如果少量siRNA进入细胞，作用于基因后，有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。建议先用FAM-NC来确定一下转染效率。找到一个最佳（大于70%）的转染条件，就用这个条件来做目的siRNA干扰实验。FAM-NC转染后6-24小时间观察一下，转染进去的整个细胞是绿的，没有转染进去的是一些绿色的小点（FAM-NC和转染试剂形成的复合体颗粒）粘附在细胞上，发的光是点状的。
2、检测时间点：建议转染后24-48小时检测基因水平变化，48-72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期不同，siRNA干扰是抛物线形的，多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。
3、引物位置：我们推荐RT-PCR的引物设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。
4、RNA降解：收到后建议-20℃保存，溶解后要最小量分装，-20℃最好-80℃保存，3个月内用完，避免反复冻融或者4℃保存。干粉保存最长不要超过6个月，使用的管子、枪头要无酶处理。
5、干扰靶点不合适：建议更换其他siRNA位点。如果您订购的是我们siRNA套餐，在转染效率达到70%以上时，或者阳性对照干扰效率达到70%，目的基因没有达到既定干扰效果，提供相关结果过来，我们再免费重新设计合成一次哦。
6、基因问题：如果基因表达量非常低，或者功能比较特殊，要受到比较严格的细胞调控，或者是核内lncRNA，这样siRNA也不容易干扰。这样可以考虑用crisper或者ASO来做。
看完这些，您清楚siRNA使用细节了吗？如果还是不清楚，可以和我们的吉玛技术支持联系哦